今天我們通過(guò)介紹一篇Cell文章，說(shuō)一個(gè)有意思的現(xiàn)象：SNP位點(diǎn)可同時(shí)作為啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，其轉(zhuǎn)換由基因型決定，結(jié)果是一個(gè)基因產(chǎn)生不同的RNA，從而參與疾病發(fā)生發(fā)展。

Risk SNP-Mediated Promoter-Enhancer Switching Drives Prostate Cancer through lncRNA PCAT19.Cell 2018 Jul 26;174(3)

風(fēng)險(xiǎn)SNP介導(dǎo)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)化通過(guò)lncRNA PCAT19促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展，這里我們關(guān)注幾個(gè)關(guān)鍵詞：SNP位點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、lncRNA PCAT19和前列腺癌。

增強(qiáng)子是能夠增加啟動(dòng)子活性從而增加基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列。

下面我們直接看文章

一、SNP位點(diǎn)rs11672691與患者預(yù)后及l(fā)ncRNA PCAT19表達(dá)關(guān)系

首先前期GWAS分析報(bào)道SNP位點(diǎn)rs11672691與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)和患者死亡率相關(guān)，接下來(lái)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)CPC-GENE研究中的127位患者的RFS和SNP的基因型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GG基因型患者生存率顯著更低：

接下來(lái)通過(guò)eQTL分析SNP基因型與1-Mbp內(nèi)基因表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與lncRNA PCAT19最相關(guān)：

由于lncRNA PCAT19有多個(gè)異構(gòu)體，其中前列腺癌中表達(dá)最高的是兩條lncRNA PCAT19-short和lncRNA PCAT19-long：

注意箭頭處的不同轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS。

接下來(lái)eQTL分析發(fā)現(xiàn)SNP基因型與short和long的相關(guān)性正好相反：

G/G型 short表達(dá)低；long表達(dá)高

這樣就把已經(jīng)報(bào)道的前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)與lncRNA的不同異構(gòu)體的表達(dá)建立起來(lái)了聯(lián)系。

二、位于short啟動(dòng)子的非風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)更偏重被轉(zhuǎn)錄因子NKX3.1和YY1結(jié)合

首先看一下SNP位點(diǎn)與lncRNA的關(guān)系：

紅色箭頭指的是rs11672691和 LD SNP rs887391位點(diǎn)的位置，我們可以看到其位于short啟動(dòng)子上游和long的（第三）內(nèi)含子。

而這個(gè)位置正好是轉(zhuǎn)錄因子NKX3.1和YY1的結(jié)合區(qū)域，且Chip-seq實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子更偏重與非風(fēng)險(xiǎn)序列結(jié)合：

圖中紅色箭頭指的是兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的偏好性，我們可以看到兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子更偏好于結(jié)合非風(fēng)險(xiǎn)的序列。

三、SNP位點(diǎn)通過(guò)介導(dǎo)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換調(diào)控異構(gòu)體表達(dá)

前面已經(jīng)證明了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子更偏重結(jié)合非風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，而非風(fēng)險(xiǎn)基因型與兩條lncRNA異構(gòu)體的表達(dá)關(guān)系是：short表達(dá)更高，而long表達(dá)低。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行的基因沉默也證實(shí)了short的表達(dá)顯著降低，而long則出現(xiàn)了表達(dá)升高：

結(jié)果中轉(zhuǎn)錄因子沉默導(dǎo)致short表達(dá)降低可以說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子對(duì)short啟動(dòng)子結(jié)合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；而對(duì)long的影響原因是不清楚的。

接下來(lái)，通過(guò)CRISPRi和CRISPRa分別干預(yù)SNP位點(diǎn)（位于short的啟動(dòng)子區(qū)域），結(jié)果是long的表達(dá)分別降低和升高，而short的表達(dá)也是降低和升高：

這里的結(jié)果就有意思了：對(duì)short來(lái)說(shuō)啟動(dòng)子的活化表達(dá)導(dǎo)致其表達(dá)升高，可導(dǎo)致long升高是怎么回事呢？

進(jìn)一步的，根據(jù)Roadmap Epigenomics（前期研究）和Chip-seq的結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)具有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的組蛋白修飾（H3K4me3和H3K4me1 ）

特性（下圖紅框），因此推測(cè)SNP位點(diǎn)通過(guò)不同基因型介導(dǎo)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換：

下面就是驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)了，用到的是熒光素酶報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的活性（luciferasebased promoter and enhancer assays），結(jié)果發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)有更高的增強(qiáng)子活性，而非風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)有更高的啟動(dòng)子活性：

前面我們已經(jīng)證明了SNP位點(diǎn)所在位置是short的啟動(dòng)子發(fā)揮作用，下面進(jìn)一步來(lái)證明這個(gè)位點(diǎn)在的區(qū)域作為long的增強(qiáng)子。首先分析了DHS信號(hào) (DNase I hypersensitive, 染色體開(kāi)放區(qū)域的一個(gè)指標(biāo))與long啟動(dòng)子的相關(guān)性，接下來(lái)通過(guò)3C實(shí)驗(yàn)（chromosome conformation capture 3C assay）結(jié)果發(fā)現(xiàn)long 啟動(dòng)子與SNP位點(diǎn)所在區(qū)域有更強(qiáng)作用，且作用富集在SNP位點(diǎn)：

到這里，這篇文章中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題就解決了：前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)SNP位點(diǎn)通過(guò)不同基因型介導(dǎo)所在區(qū)域作為lncRNA PCAT19的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控兩者表達(dá)，對(duì)應(yīng)關(guān)系是：SNP風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)——long的增強(qiáng)子活性——long高表達(dá)；SNP非風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)——short的啟動(dòng)子活性——short高表達(dá)。

四、lncRNA PCAT19 long通過(guò)活化細(xì)胞周期基因促進(jìn)前列腺癌

上面這個(gè)問(wèn)題解決后，下面就是long的的功能和下游機(jī)制了。

功能上用了三種敲減技術(shù)：siRNA，ASO和shRNA，從體內(nèi)和體外研究細(xì)胞的增殖、侵襲遷移能力：

細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)long促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展

初步機(jī)制上，先通過(guò)RNA-seq找差異基因，GO分析顯示細(xì)胞周期被最顯著富集；接下來(lái)TCGA數(shù)據(jù)分析long表達(dá)與細(xì)胞周期基因關(guān)系、患者預(yù)后關(guān)系；最后檢測(cè)long敲減后周期基因表達(dá)：

這一步解決的問(wèn)題是long發(fā)揮作用的下游機(jī)制初步探索，明確的是long調(diào)控的作用通路（細(xì)胞周期）和基因，但沒(méi)有解決的是long的直接作用靶點(diǎn)。

具體靶點(diǎn)的確定：首先做long的細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)定位與細(xì)胞核；接著是long的RNA pulldown+質(zhì)譜/WB檢測(cè)和CHIRP（chromatin isolation by RNA pull-down）驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作用蛋白是HNRNPAB；再通過(guò)RIP反向驗(yàn)證：

HNRNPAB與long直接結(jié)合

long通過(guò)HNRNPAB發(fā)揮作用：HNRNPAB與long直接結(jié)合不等于long通過(guò)HNRNPAB發(fā)揮功能，所以從表型和靶基因調(diào)控的類(lèi)似性說(shuō)明：

（1）HNRNPAB對(duì)前列腺癌的表型影響與long類(lèi)似；

（2）HNRNPAB與long調(diào)控的靶基因類(lèi)似：

最后是整篇文章作用機(jī)制的示意圖：

到這里這篇文章就介紹好了，下面我們來(lái)說(shuō)一個(gè)問(wèn)題：SNP的研究還有沒(méi)有創(chuàng)新性？

很多人說(shuō)SNP的研究已經(jīng)做了這么多年，沒(méi)有創(chuàng)新性了，這個(gè)問(wèn)題要看你怎么考慮。在這篇文章中SNP與lncRNA基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合起來(lái)發(fā)的是Cell雜志；如果沒(méi)有SNP介導(dǎo)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換這個(gè)部分的工作，就只看這篇文章中l(wèi)ncRNA PCAT19的工作量的話(huà)，文章很難超過(guò)10分，甚至5分都難。

另外，我們以前推過(guò)另外一篇文章：一篇22分的NG教你如何設(shè)計(jì)課題，這篇文章中SNP也是與lncRNA聯(lián)合起來(lái)研究的，只不過(guò)SNP位點(diǎn)位于lncRNA內(nèi)部，對(duì)lncRNA的影響也是影響到lncRNA的不同作用方式：

所以我個(gè)人認(rèn)為：只有外行才會(huì)說(shuō)一個(gè)方向沒(méi)有創(chuàng)新性了，不是沒(méi)有，是你不知道怎么做。

文章來(lái)源：小張聊科研

IEEE Spectrum

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