隨著世界人口的增長和生態環境的惡化，重大流行病毒爆發和新病毒的出現頻率不斷增加，給社會造成恐慌和巨大的經濟損失。由于許多病毒的侵染途徑與致病機制尚不清楚,抗病毒藥物以及疫苗的研制嚴重滯后，因此病毒感染的防治工作面臨著嚴峻地挑戰。近年來，光學成像技術已經成為現代生物醫學領域中研究病毒侵染的重要技術手段。然而，目前可用于病毒標記示蹤的方法均因操作復雜或病毒活性降低等問題而難以推廣應用。相反，通過納米生物醫學技術卻為可視化研究病毒的侵染過程提供了可能。

中國科學院深圳先進技術研究院蔡林濤研究員團隊以流感類病毒顆粒（H5N1p）與桿狀病毒（Baculovirus）為模型，利用量子點等納米熒光標記物通過生物正交化學（Bioorthogonal chemistry）對病毒進行無損標記，并在活體水平對病毒實現動態示蹤，監測其侵染行為。該研究針對活病毒標記與活體示蹤存在病毒活性減弱與動態可視化困難的瓶頸，通過合成具有良好生物相容性的生物代謝探針，發展一系列基于生物正交反應的熒光標記技術，在宿主體內成功實現對活病毒的高效、特異、無損的原位標記，從而最大限度地保存病毒的侵染能力；同時，運用活體示蹤技術，動態監測病毒在感染組織中的侵染途徑，篩選與評估抗病毒藥物活性，并結合病毒定位和分子生物學手段，進一步揭示了病毒與宿主間的相互關系，為全面解析病毒的致病機制提供重要的理論依據和技術手段。這一系列研究成果先后發表在J. Am. Chem. Soc., ACS Nano, Small等國際重要期刊上發表。

目前，病毒熒光探針標記普遍存在熒光容易淬滅，不能長時間檢測的難題，研究團隊采用咪唑多聚物配體為修飾劑，一步法合成攜帶報告基團量子點（N3-QDs）,并通生物正交反應與配對基團連接的桿狀病毒（DBCO-Bac）形成穩定的共價連接。運用激光共聚焦顯微鏡可長時間監測桿狀病毒在細胞內的運動情況，直至病毒感染48 h后報告基因在感染細胞中表達，量子點仍具有很強的熒光信號（圖1）。該量子點粒徑小（～12 nm），光學特性優良，生物相容性好，是一種理想的納米熒光探針；同時，病毒與量子點通過生物正交連接形成穩定的共價鍵，因而具備很好的特異性與穩定性。這些技術特性可以使研究者有更長的時間在細胞水平持續監測病毒復雜的感染行為。

鑒于在細胞水平上示蹤病毒，所獲得信息量比較有限，實驗數據也不能真實反映病毒在病人體內的感染情況，因此病毒在活體水平上的示蹤研究顯得十分重要。該研究團隊以Balb/c小鼠為感染模型，在上述基礎上通過合成一種疊氮修飾的近紅外量子點（NIR N3-QDs 750nm）并通過生物正交反應連接到流感類病毒顆粒表面，運用活體成像技術對流感病毒顆粒在肺部的侵染過程進行動態示蹤。研究結果顯示，在小鼠肺部有很強的量子點熒光信號并且與病毒顆粒完全共定位。在小鼠體內檢測量子點熒光信號的位置與強度能夠很好的示蹤并定量病毒，這一結果得到了電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）定量與組織免疫熒光共定位的證實(圖2)。同時，該病毒活體示蹤模型還可用于抗病毒藥（達菲）與抗血清治療效果的評價工作，將來可發展為一種抗病毒藥物篩選與評估平臺。

由于上述病毒標記都是基于病毒的直接化學修飾（DBCO修飾病毒），通常是以病毒表面的蛋白作為修飾位點，因缺乏選擇性，許多與受體結合的病毒表位被覆蓋，存在高劑量修飾會降低病毒活性缺點。該研究團隊為克服這一問題，以細胞代謝工程與生物正交化學為基礎，發展出一種全新的活體病毒原位標記與示蹤技術。該技術通過病毒宿主細胞脂類代謝將膽堿衍生物（AE-Cho）的疊氮基團無損修飾到病毒囊膜表面，在肺部感染處，疊氮修飾的病毒顆粒（N3-H5N1p）與外源 DBCO-熒光探針通過特異的生物正交反應，成功將熒光探針原位標記到病毒表面，在活體水平上實現對病毒侵染過程的熒光動態示蹤（圖3）。該病毒標記技術運用細胞代謝修飾與體內原位標記的策略，更大程度上保存病毒的生物學活性，而傳統的標記方法使病毒的侵染活性降低30%；同時，傳統方法標記的病毒誘導宿主細胞因子（IL-1b，IL-6，TNF-a）的表達與病理損傷水平也出現顯著下降。這種體內病毒原位標記是通過脂類代謝修飾與生物正交連接完成的，它首次在活體內實現對病毒"高保真"的標記與“時空耦合”的動態示蹤，這將有助于"可視化"研究病毒－宿主間的相互作用，為深入研究病毒活體內的侵染機制提供可靠的技術手段。

該研究團隊以生物正交反應作為病毒標記的技術核心，通過化學合成光學特性優良的量子點和生物探針作為熒光標記物對活病毒進行標記與示蹤研究，它將病毒研究由細胞水平成像發展到活體動態示蹤，由直接化學修飾演變到無損的原位代謝標記。這項技術將活病毒的可視化研究與納米生物醫學工程緊密結合，拓寬了該技術在生物醫學影像的研究對象及應用范圍。

生物醫學工程研究與成果的轉化一直以來是該研究團隊的主要目標。該技術不僅在病毒示蹤研究方面具有很強實用性與有效性，而且其相關產品在生物醫學工程領域具有很好的轉化與應用前景。潛在的產品主要包括光學性能優越的納米熒光量子點與無損標記的生物代謝探針。基于生物正交的熒光納米標記物（NIR N3-QDs）,由于制備工藝相對簡單，產率較高，具有很高的產業與轉換的潛力，在生物醫學標記與影像領域有著廣泛的應用市場。同時，生物代謝探針（AE-Cho）由于其高效、無損的細胞脂類代謝修飾，可廣泛用于具有膜結構的生物靶標的無損修飾與標記，該產品已申請發明專利，將來也可用于公司技術轉讓與工業化生產。這種示蹤技術及產品將來在非病毒研究領域，如腫瘤醫學成像、活細胞體內示蹤、分子定點標記、藥物靶向治療、干細胞示蹤、腸道菌群遷移等生物醫學領域也有著廣闊的產業化應用前景。

科學研究的目的是為了更好的服務于探索未知領域與臨床診療實踐，我們期待這種多學科交叉碰撞出的前沿研究與應用，能盡快轉化為產品并進入市場，爭取更好地造福于社會大眾。

致謝：該項目獲得國家納米重大科學研究計劃（項目編號：2011CB933600）、國家自然科學基金（項目編號：81601552、81501591）、科技部國際合作、廣東省自然科學基金研究團隊、廣東省納米醫藥重點實驗室等基金支持。

（編輯：小智）